Modélisation et optimisation du tri parallélisé des nanopores immunomagnétiques pour l'isolement spécifique des marqueurs de surface des vésicules extracellulaires à partir de milieux complexes

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 13292 (2023) Citer cet article

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L'isolement de sous-populations spécifiques de vésicules extracellulaires (VE) en fonction de leur expression de marqueurs de surface pose un défi important en raison de leur taille nanométrique (< 800 nm), de leur expression hétérogène de marqueurs de surface et du grand nombre de EV de fond présents dans les échantillons cliniques. (1 010 à 1 012 EV/mL dans le sang). Le tri nanomagnétique hautement parallélisé à l’aide de puces à nanopores magnétiques gravés sur piste (TENPO) a permis d’obtenir un tri immunospécifique précis avec un débit élevé et une résilience au colmatage. Cependant, il n’y a pas encore eu d’étude systématique des paramètres de conception qui contrôlent les compromis en termes de débit, de récupération cible des EV et de capacité à éliminer les EV en arrière-plan dans cette approche. Nous combinons la simulation par éléments finis et la caractérisation expérimentale des puces TENPO pour élucider les règles de conception permettant d'isoler les sous-populations EV du sang. Nous démontrons l'utilité de cette approche en réduisant l'arrière-plan du dispositif > 10 × par rapport aux conceptions publiées antérieures sans sacrifier la récupération des EV cibles en sélectionnant le diamètre des pores, le nombre de membranes placées en série et le débit. Nous comparons les véhicules électriques isolés par TENPO à ceux des méthodes d'isolement des véhicules électriques de référence et démontrons leur utilité pour une application et une modularité étendues en ciblant des sous-populations de véhicules électriques provenant de plusieurs modèles de maladies, notamment le cancer du poumon, le cancer du pancréas et le cancer du foie.

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des particules membranaires à l'échelle nanométrique (< 800 nm) contenant des cargaisons d'acide nucléique et exprimant des protéines de surface qui reflètent leurs cellules d'origine1. En raison de leurs multiples cargaisons et de leur capacité à contourner les barrières anatomiques telles que la barrière hémato-encéphalique pour circuler dans les fluides corporels périphériques tels que le sang (1 010 à 1 012 EV/mL)2 et l’urine (1 010 EV/mL)3, les véhicules électriques sont devenus une source prometteuse de biomarqueurs pour le diagnostic et la caractérisation de plusieurs cancers4,5,6,7,8,9, ainsi que dans d’autres contextes pathologiques, notamment les traumatismes crâniens10 et les maladies infectieuses11. De plus, les véhicules électriques jouent un rôle mécaniste dans des processus biologiques tels que l’ensemencement métastatique12 et les interactions tumeur-immunité dans le cancer13, ainsi que dans des pathologies telles que les traumatismes crâniens14, les maladies auto-immunes15 et les arrêts cardiaques16.

Actuellement, l’étude des véhicules électriques et leur potentiel diagnostique et thérapeutique sont freinés par une technologie qui n’a pas été conçue pour répondre à leur combinaison unique de taille nanométrique, de complexité et de quantité dans les échantillons biologiques. La concentration élevée de véhicules électriques dans le sang pose un défi particulier aux enquêteurs cherchant à différencier une sous-population spécifique de véhicules électriques des autres sous-populations de véhicules électriques, ainsi que d'autres particules non-VE telles que des débris cellulaires de la même taille (« contexte » non pertinent) . Les méthodes actuelles d’isolement des EV, telles que l’ultracentrifugation, les kits de précipitation commerciaux (Thermo Fisher, System Biosciences) et la chromatographie d’exclusion de taille, ne disposent pas de la sélectivité et du débit des marqueurs de surface nécessaires pour trier avec précision les sous-populations d’EV17.

De même, les méthodes précédemment établies pour le tri des cellules par marqueurs de surface sont incapables de mesurer les véhicules électriques à l’échelle nanométrique ou d’atteindre le débit nécessaire pour traiter le grand nombre de véhicules électriques généralement trouvés dans les échantillons cliniques. Par exemple, le traitement d’environ 1 011 EV dans 1 ml de sang ne serait pas réalisable pour la cytométrie en flux cellulaire à haut débit. Les cytomètres en flux de nanoparticules classiques trient à une vitesse d'environ 1 000 comptes/seconde18, ce qui nécessite environ 3 ans pour trier 1 ml de sang, tandis que même les derniers systèmes de cytométrie en flux subcellulaire triant à environ 60 000 événements/seconde19 nécessiteraient 19 jours pour 1 ml de sang. sang. Ce défi est amplifié par la faible expression absolue des protéines de surface sur les EV par rapport aux cellules en raison de la surface considérablement accrue d'une cellule d'environ 10 µm par rapport à un EV < 800 nm, produisant ainsi des signaux fluorescents inférieurs au niveau de détection pour systèmes commerciaux de cytométrie en flux20. En réponse à ce défi, plusieurs approches microfluidiques ont été développées en utilisant des tailles de caractéristiques micro/nano-échelles de taille EV pour effectuer un tri EV de précision basé sur la taille ou par marqueur de surface. Cependant, des limitations telles que l’exigence d’une nanofabrication complexe4,21,22, de faibles volumes d’entrée maximaux23,24, le recours à une seule cible de biomarqueur moléculaire25 ou un faible débit d’échantillons21 ont entravé l’applicabilité du tri microfluidique par taille ou marqueur de surface EV.

107 pores/cm2 for d = 600 nm pores5, > 106 for d = 3 µm pores per Cytiva/Whatman). Lastly, track etching combined with vapor deposition of a bilayer, consisting of a soft magnetic layer of NiFe and a passivation layer of Au, offers inexpensive fabrication of large numbers of precisely-defined magnetic nanopores while bypassing expensive and difficult-to-scale lithography5./p> 10% of the magnetic nanopores become occluded. This feature arises because the fluidic resistance of the magnetic nanopores is several orders of magnitude greater than the resistance between pores, and as such when a pore is occluded the flow is distributed not only to its nearest neighbors, but uniformly over the entire 107 pores as if they are in connected in a parallel circuit27. Moreover, in many applications of isolating specific sub-populations of EVs, the subpopulation is sparse (ex. ~ 1900 tumor-derived EVs/mL per mm3 of tumor volume for highly-shedding tumors)28 in comparison to the total number of EVs. Therefore even in a case when TENPO processes 1011 EVs in a mL of human plasma, several orders of magnitude less targeted EVs are captured on the TENPO’s ~ 107 magnetic nanopores. Because our device sorts EVs one at a time, in a device that is matched in scale to that of nanoscale EVs, it can sort EVs based on quantitative expression of surface markers, akin to flow cytometry for cell based sorting. This is in contrast to conventional methods that use micrometer-scale sized beads or devices29, where EV capture is dictated by a single binding event. Moreover, previous immunoaffinity bead isolation methods have been limited by the requirement that a high proportion of EVs express a given target protein30./p>

2.5 mL/h, Rs decreased as a function of flow rate ɸ. At flow rates ɸ < 2.5 mL/h, 1-Rw increased as a function of ɸ, and beyond ɸ > 2.5 mL/h, all weakly targeted EVs were successfully discarded. (Fig. 2C). This model system demonstrates the potential for tuning the tradeoff between Rs and 1-Rw in this model scenario featuring both targeted EVs and off-target EVs with non-specifically bound MNPs./p> 33)./p> 10 mL/h rather than decreasing (Fig. 3C, SI Fig. 11). This difference may be due to differences in magnetic labeling where EVs with greater than 15 MNPs are still captured at high flow rates. We observed no change in isotype-labeled EV RNA at any of the flow rates, in contrast to the predicted decrease in background on simulation. As in the membrane number scan, we hypothesize that the isotype background Cq values are closer to the limit of detection of our PCR assays. We observed the greatest difference between the antibody-labeled versus isotype-labeled EVs at a flow rate of ɸ = 2.5 mL/h (Fig. 3C, SI Fig. 11)./p> .05), while for GAPDH there was a significant difference between the antibody replicates (p = .014) but not the isotype replicates (p > .05)./p> 1000) of clinical samples are required. By virtue of its low construction/operation cost (cost for one pan-EV prototype TENPO assay = ~ $35; $12 material/fabrication5, $5 antibody, $18 beads) and compatibility with roll-to-roll manufacturing, TENPO could be scaled up to fast chip manufacturing while also having the throughput for large clinical cohorts. The fabrication cost of TENPO is invariant to pore diameter, unlike most microfluidic approaches which rely on lithographic fabrication. Previous work in our group with TENPO using 600 nm pores to isolate EV subpopulations was able to yield clinically-relevant diagnostic information in n = 204 pancreatic cancer samples6 as well as in n = 96 traumatic brain injury samples10. In these cases, TENPO using 600 nm pores was able to distinguish biological nucleic acid signals from background, which can be improved even further with the 10× improvement in specificity versus isotype background suggested in this manuscript./p>

~ 3 × 109 EVs for pancreatic cancer, 1 mL—> ~ 9 × 1010 for lung cancer, 1 mL—> ~ 9 × 108 for liver cancer) into healthy human plasma (0.75 mL healthy human plasma for pancreatic cancer, 0.25 mL healthy human plasma for lung and liver cancer; plasma has an EV concentration of 2 × 1012 EVs/mL as measured via NTA). Equivalent volumes of non-conditioned clean culture media (media not exposed to cancer cells) were added to the volumes of healthy human plasma stated for each cancer media type to make the “healthy” samples./p>